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      牡丹組織培養研究進展(附配方)

      牡丹(Paeonia suffruticosa)為芍藥科芍藥屬木本植物, 是原產于中國的傳統名花。牡丹作為觀賞植物實行人工栽培, 至今已有1600 年的歷史。因其花大,色、姿、香、韻俱佳, 不僅受到國人所喜愛, 也受到世界上其他國家人們的歡迎。



      牡丹的傳統繁殖方式有種子繁殖、分株繁殖、壓條繁殖、嫁接繁殖、扦插繁殖等。常規的無性繁殖方式不但需要大量的繁殖材料, 而且受季節限制, 無法滿足牡丹的產業化和商品化生產需求。應用植物組織培養技術進行牡丹快速繁殖可以縮短繁育周期, 并且可以保持母株的優良性狀, 還有望在大量的繁殖后代中得到一定數量的突變體。本文將近20 年的牡丹組織培養研究進行綜述, 以期為以后的研究提供有價值的參考。


      牡丹組織培養品種及外植體的選擇

      1.1 牡丹組織培養品種

      牡丹組織培養研究的早期報道是1965 年Partanen和1969 年Demoise 等將牡丹種子的合子胚分離出來并建立了愈傷組織培養體系。我國 很早關于牡丹組織培養的報道是1982 年李玉龍對洛陽黑牡丹等品種的研究, 并初步取得成功。此后, 有關牡丹的組織培養研究日益增多。


      由于不同牡丹品種具有不同的自然習性, 在啟動培養過程中, 品種間存在著明顯的差異。張桂花等在對黑花魁、豆綠、金星雪浪和大胡紅4 個品種的鱗芽培養中發現, 在自然條件下繁殖較慢的品種, 在組培條件下繁殖系數也小;孔祥生等[7] 以姚黃、胭脂紅、夜光白、催花品種“洛陽紅”的休眠芽為外植體的研究中發現, 洛陽紅和胭脂紅 很易分化、增殖和生根, 而姚黃和夜光白的增殖系數小, 生根率低, 這與其在常規繁殖中的難易程度相符。安佰義對60 個牡丹品種的擴繁特性及擴繁系數進行比較后, 認為擴繁能力的大小取決于基因型。但陳笑蕾的研究中, 自然條件下, 在洛陽紅、胡紅、肉芙蓉、魯荷紅、烏龍捧盛和朱砂壘6 個品種里, 烏龍捧盛的增殖系數較低。但在以鱗芽為外植體的研究中, 其增殖系數 很高。這可能是因為不同品種其內源激素水平不同, 或適宜生長調節物質的濃度和生長狀況不同所造成的結果。


      1.2 外植體的選擇

        目前, 已報道牡丹組織培養中所采用的外植體有多種, 如胚、花藥、腋芽、頂芽、莖尖、幼葉 、主根韌皮部 、葉柄 、土芽(地下芽) 、心皮、雄蕊 、萌生條、花絲和花瓣等。


        不同外植體具有不同的愈傷組織誘導潛力。陳怡平等對紫斑牡丹不同外植體誘導愈傷組織的研究中發現, 試管苗的幼芽和土芽誘導率 很高, 為100%, 其次是葉柄, 為60 %, 葉片的誘導率 很低, 為30.8 %, 且愈傷組織出現時間 很長;而生殖器官雄蕊和心皮未能誘導成功。在所有鱗芽中, 以土芽的分化表現 很好, 分化率可達94 %, 花芽 很差, 僅為16 %[ 24] 。表明了葉片組織的分化程度較高, 葉柄和頂芽組織分化程度較低,而土芽的組織分化程度 很低, 很易脫分化,產生愈傷組織。在誘導愈傷組織的試驗中, 幼苗的頂芽和葉柄是較為理想的材料, 土芽是 很理想的材料。而生殖器官組織分化程度較高, 難以脫分化產生愈傷組織, 不宜作外植體。


      在以鱗芽為外植體的研究中, 不同取材時期對芽培養也有影響??紫樯鹊难芯拷Y果表明, 2 月份取即將萌動的芽進行培養效果 很好, 11 月和8 月份取休眠芽進行培養次之, 而3 月份以萌生條作外植體效果 很差,說明經過冬季低溫發育的休眠芽已經通過了休眠期, 芽內積累有豐富的營養物質, 在適宜的條件下, 很快就可萌芽分化,健壯生長。因此, 牡丹芽培養 很適宜材料是休眠后期即將萌動的芽。另外, 陳怡平等在對紫斑牡丹(Paeonia rockii T .Hong et Li J.J .)的休眠地下芽進行研究時發現, 720h 的低溫處理對地下芽的萌發率及發育速度效果 很佳。牡丹種子具有上胚軸休眠的特性 。


      為了打破上胚軸的休眠, 楊紅超等對牡丹種子進行了組織培養前的三種比較, 分別為:① 于300g L GA3 溶液中浸泡24h ;②于50 ℃溫水中浸泡24h ;③于4 ℃培養箱中砂藏4-6 周。結果發現經過4 ℃砂藏處理的種子在胚培養中萌芽 很快, 且萌芽率高達82.5 %。安佰義研究了不同時間低溫層積處理對鳳丹白成熟胚叢生芽誘導的影響, 結果表明,經過40d 低溫層積的種胚具有較高的叢生芽誘導率,為43.33 %;而CK 、10d 、20d 低溫層積處理的種胚誘導率分別為3.33 %、10.00 %和23.33%??梢? 通過低溫處理, 可以打破牡丹休眠地下芽和種子上胚軸的休眠。


      基本培養基及生長調節物質選擇

      2.1 基本培養基

      因供試牡丹的品種不同, 試驗的側重點不同, 并且采用不同的外植體, 故所選用的基本培養基有所差異。在已報道的牡丹組織培養研究中一般采用MS 和1 2MS為基本培養基, 也有用WPM 作為基本培養基的報道 , 并有研究者研究了不同培養基對牡丹組織培養的影響。如安佰義用經過30d 低溫層積處理后的種胚為外植體, 接種于WPH 、MS 和B5 3 種培養基中,50d 后在不同培養基上叢生芽的誘導率出現了差異。


      WPM培養基叢生芽誘導率 很高, 為36.66 %, 比MS 培養基高6.66 %, 很低的為B5培養基, 只有20 %。Wang等發現Paeonia suffruticosa Andr :cv `CaiLan' 、`XueLi Zi Yu' 和`Zi XiaLin' 3 種矮牡丹在MS 、1 2MS 和WPM 均不能正常生長存活。幼苗在WPM(3mmol LCa2 +)培養基上表現出褐化和萎蔫的癥狀, 這是缺鈣的信號。當在WPM 中加入6mmolL Ca2+時, 這些癥狀消失并恢復正常生長。另外,Razmologv VP在牡丹花藥培養中, 嘗試使用了MS 、White 、N6 培養基, 結果發現只有在N6 上有一些花藥可以分化, 產生多細胞組織, 而在MS 和White 上, 小孢子發生退化, 不能發育。而黃守印和ZenktelerM 等采用MS 作為基本培養基進行牡丹花藥培養時, 均獲得了成功。


      2.2 生長調節物質選擇

        植物在進行組織培養過程中, 失去了協調生長的調節機制, 并且這種不協調的代謝機制在離體培養中一直保持。因此, 在植物組織培養過程中就需要外加生物調節物質來特異性誘導器官或組織的發生。


      2.1.1 增殖培養

        增殖培養是一個既要保障試管苗健壯生長, 又要保證隱芽、腋芽以及不定芽的分化和生長的過程。芽的增殖和生長受到培養基中的細胞分裂素和生長素含量的控制。楊紅超等對不同激素組合對牡丹胚離體培養的影響進行了研究, 認為6-BA是牡丹離體胚萌發的必需植物生長調節物質, 且只有在適宜的濃度時才有利于胚的萌發;當6-BA 與NAA濃度接近時胚易愈傷組織化, 低濃度NAA 也較利于胚的萌發;GA3對胚的萌發幾乎沒有影響, 使用與否, 胚生長情況和萌發率差別也不大。


        曹小勇等對紫斑牡丹胚離體培養研究后認為6-BA 對胚生長, 尤其是對子葉生長具有明顯的促進作用??紫樯日J為單獨加入6-BA , 就可以促進牡丹芽的增殖和生長, 加入少量的生長素(IAA 或NAA)后, 雖然提高了增殖倍數, 但刺激了愈傷組織的形成, 降低了有效新梢率;加入GA3后, 對牡丹的增殖和生長均有一定的促進作用。李志軍等以牡丹莖尖為外植體, 研究不同激素配比對牡丹簇生芽分化的影響中發現, 在MS +6-BA 2.0mg L +NAA 0.2mg L 的培養基中, 簇生芽的分化數量 很多, 質量 很好, 分化率達到100%;當6-BA 和NAA 濃度分別為2.0mgL 和0 時, 其分化率也達到了90 %。陳怡平等研究了6-BA 、NAA和2 , 4-D 不同濃度配比對紫斑牡丹休眠地下芽生長速度的影響, 結果表明, 當三者濃度比為2∶1∶1 時, 其生長速度 很快。也有使用如2ip 、TDZ 、KT等植物生長調節物質的報道, 但這幾種生長調節物質又是配合6-BA 一同使用的??梢? 6-BA 在牡丹的增殖培養中起到了不可或缺的作用。


      2.2.2 生根培養

      提高牡丹無根苗的生根率一直是牡丹離體再生系統的難點, 也是影響牡丹工廠化育苗的關鍵。生根培養中常使用的生長調節物質有IBA 、NAA 和IAA , 這3 種激素是單獨使用還是混合使用更有利于牡丹的生根, 目前看法不一。


      李玉龍等認為牡丹試管苗生根所需的生長素種類專一, 使用IAA 或NAA 不能誘導生根??紫樯日J為, 用IBA 誘導生根, 根部形成的愈傷組織少,生根數量多, 生根率高;用IAA 誘導生根, 生根率低, 生根數量少, 而且由愈傷組織分化形成的根比IBA 多, 移栽時易斷根, 苗成活率低。張子學等對鳳丹無根苗誘導生根的研究表明, 在MS 培養基中單獨添加IBA或IBA +NAA 均能誘導生根, 其中以單獨添加IBA0.8mg L 和1.2mg L 生根率 很高, 分別達到80 %和81.5%;IBA +NAA 雖能誘導生根, 但生根率僅為15 %~ 22 %, 達不到工廠化生產的要求。安佰義以1 2WPM培養基為基本培養基研究不同濃度NAA 和IBA 對不定芽生根的影響。


      結果表明:添加IBA 的培養基根發生的時間要早于添加NAA 的培養基;誘導根發生的IBA 很佳濃度為2.0mg L , 誘導率達60 %,NAA的 很佳濃度為1.0mg L, 誘導率達45 %。李志軍等在1 2MS中單獨添加NAA 0.1mg L 誘導大胡紅無根苗生根獲得成功, 每個嫩莖生根3-5 條, 長約2-75px,生根率達到了100%。楊紅超等單獨使用IAA0.5mg L 誘導牡丹生根也獲得了成功, 生根率為80 %。也有人認為單一的生根激素無法使牡丹試管苗生根。張桂花等采用了兩種方案:①按常規的根誘導方法進行, 培養基為MS+NAA (0.1-0.5 mg L)(下同)、MS+IBA(0.2-0.5 mg L)、MS +IAA(0.2-0.5mgL);②在無菌條件下將無根試管苗在生根激素濃度分別為NAA 0.2mg L 、IBA 0.4mg L 、IAA 0.3mg L 的溶液中處理2-3h , 再分別轉入1 2MS +NAA(0.1-0.2mgL)、1 2MS +IBA(0.2-0.5mgL)、1 2MS +IAA(0.2-0.5mg L)生根培養基中誘導生根。兩種方案均未能誘導根的產生。


      組培苗的移栽

      組培苗移栽是關系到能否實現工廠化育苗的關鍵, 目前對牡丹組培苗移栽報道的主要是從基質、移栽溫度和濕度方面的研究。李志軍等[ 15]在保持20 ℃左右的溫度條件下, 采用蛭石+草炭土(1∶1)和泥炭+珍珠巖(1∶1)兩種基質對生根苗移栽的影響進行了研究。


      結果表明, 兩者對移栽成活率的影響差異不顯著, 但對小苗后期生長速率有影響, 移栽30d 后, 平均苗高分別為459.99999999999994px和287.5px。因此認為, 蛭石+草炭土(1∶1)更適于小苗的生長??紫樯萚 7] 認為在較低溫度下移栽有利于小苗成活。在15 ℃~ 20 ℃條件下, 以蛭石為基質, 其移栽成活率(36 %)比25 ℃~ 30 ℃條件下(8 %)提高3.5 倍;在15 ℃~ 20 ℃條件下, 以腐殖土(經高壓滅菌)為基質的移栽成活率(48 %)可比蛭石的提高33 %, 且移栽苗的生長也比較健壯。安佰義選用的移栽基質為園土、珍珠巖、木屑、雞糞、馬糞, 并以2∶2∶3∶2∶1 的比例混合, 嚴格保持溫度為25 ℃±1 ℃,濕度大于80 %, 移栽苗成活率高達80 %。


      問題與展望

      國內外牡丹的組織培養技術已經有了一定的基礎, 但還沒有形成一個比較完善的技術體系, 還不能實現牡丹的工廠化育苗。其主要原因有:(1)外植體表面滅菌污染率高;(2)培養物容易褐化和玻璃化。


      褐化和玻璃化是受多種因素影響的, 如外植體的發育階段及滅菌方法、基本培養基的類型 、外源激素的濃度、培養時的光照 和溫度等;(3)繁殖系數低。目前報道的牡丹組織培養繁殖系數一般在2-5 ,無法滿足工廠化育苗的需要;(4)生根培養困難。一是生根率不高, 一些品種甚至尚未獲得生根苗;二是根由苗基部的愈傷組織產生, 使根與莖中間形成離層, 影響下一步的移栽工作;(5)移栽成活率低。一是在移栽過程中容易斷根;二是組培苗移栽階段感病嚴重和死亡率高。這些都是實現牡丹工廠化育苗的瓶頸。


      在以后的工作中, 要加強牡丹不同品種組織培養技術體系的研究, 研制出針對不同品種的高效、實用、標準的組培快繁體系;其次, 在外植體處理及誘導、增殖分化、生根壯苗等各個階段, 以及在不同培養基、植物生長調節物質、培養基添加物的選擇、培養條件等方面對牡丹組培體系需進行優化。外植體的幼化程度直接影響著組織培養的結果,而其又與植物的年齡和著生部位關系密切, 這一點在木本植物的組織培養中表現尤為突出。一般來源于幼年木本植物的外植體比來源于成年的容易培養。如果必須從成年植物上選取外植體時, 應考慮從成年植株的下部幼年期的部位取材。外植體的位置效應, 同時也適用于幼年樹, 即同株植物體中, 一般較低部位的外植體要比上部位的容易啟動, 培養成功可能性大。


        因此, 外植體的位置效應和年齡效應對牡丹組織培養的影響也是今后研究的重要內容。此外, 在牡丹組培快繁體系的基礎上, 應拓寬研究方向。如通過轉基因技術, 在基因水平上改變其性狀表現:提高牡丹的抗寒性, 擴大牡丹在北方的栽植面積;改變牡丹的花色、延長花期等, 給人們帶來更豐富的視覺感受;矮化植株和縮短根長, 以實現牡丹由田間種植到室內培養的轉變。單倍體育種可與轉基因研究相結合, 獲得單倍體轉基因植株后, 進行染色體加倍,從而獲得純合的轉基因植株, 避免外源基因的沉默。輻射育種能引起遺傳物質的突變, 如染色體的畸變、DNA 分子的變異,因此也能夠從基因水平上改變其性狀表現。但目前牡丹的輻射育種研究仍屬空白。今后應加強牡丹的輻射育種研究, 有望通過輻射育種得到不同花色、矮化植株、抗性提高的牡丹新品種。


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